Des méthodes à l’essai dans les fromages au lait cru

Il existe une norme internationale, l’ISO/TS 13136, relative à la détection des formes pathogènes d’Escherichia coli (ou STEC) dans les aliments. Selon cette spécification technique, publiée en 2012, qui depuis fait référence, il faut suivre cinq étapes pour mener l’analyse : enrichir l’échantillon, extraire l’ADN total, rechercher la présence des gènes de virulence stx et eae, traquer la présence des gènes révélateurs des principaux sérogroupes pathogènes (à savoir O157, O26, O103, O111 et O145 c’est-à-dire le top 5 défini par la réglementation européenne), enfin isoler les bactéries sur gélose de façon à confirmer la co-présence des gènes stx et eae sur le même sérogroupe. Seulement cette stratégie a ses limites. Car lorsque le premier screening fait apparaître les gènes stx et eae, le principe de précaution veut que le lot soit placé en quarantaine. Or l’étape de confirmation montre, elle, que dans la plupart des cas, les gènes et stx et eae sont portés par des souches différentes, autrement dit que le produit est sans danger pour le consommateur. Comment éviter cet écueil? Existe-t-il des approches permettant de se dispenser de ces mises en quarantaine non justifiées, synonymes de surcoûts logistiques ? Désormais, plusieurs spécialistes du diagnostic mettent en avant des solutions.

L’IMMUNO-SÉPARATION COMME ÉTAPE PRÉALABLE Bio

BioMérieux a ainsi présenté, lors de son quatorzième colloque tenu à Paris le 14 octobre 2014, une méthode qui se revendique plus spécifique et mieux adaptée aux contrôles libératoires chez les fabricants d’aliments vulnérables, notamment les producteurs de fromages au lait cru. « La méthode que nous avons développée débute par une étape d’immuno- séparation automatisée, réalisée à partir du bouillon d’enrichissement, qui permet de sélectionner les sérogroupes responsables de toxi-infections collectives, et seulement eux, si l’échantillon en contient (avec un protocole qui englobe la capture d’O157, O26, O103, O111 et O145 mais aussi d’O121 et O145 c’est-à-dire le top 7 défini par la réglementation américaine). L’intérêt de cette étape d’immuno-séparation est qu’elle permet d’éliminer la majorité des réactions PCR non confirmées lors de l’isolement sur gélose. Notre méthode dispense donc de la mise en quarantaine de lots tout en ayant, par ailleurs, l’avantage de couvrir la totalité de l’analyse, depuis le prélèvement de l’échantillon jusqu’à la confirmation du résultat. Nous obtenons, dans le cas du dépistage dans les laits ou les fromages au lait cru, un résultat final en 33 à 46 heures, confirmation incluse », résume le responsable recherche et développement en biologie moléculaire, Patrick Chablain.

Selon une technologie propriétaire, la première étape du protocole, celle d’immunoséparation, est réalisée sur la base d’une reconnaissance via des protéines recombinantes de phages, effectuée sur automate Vidas; c’est-à-dire la technologie utilisée depuis longtemps par BioMérieux, mais cette fois exploitée suivant des modalités particulières. « Ici nous utilisons le Vidas, non pas pour détecter des bactéries cibles, mais pour extraire l’ADN des E.coli du top 7.Tout aussi nouveau: nous avons mis au point une même barrette qui sert à extraire l’ADN de ces bactéries, puis à concentrer des formes vivantes de ces bactéries avant l’étape d’isolement, lorsqu’à la fois le premier et le deuxième screenings sont positifs », explique le responsable recherche et développement. Ces étapes de screening par PCR sont, elles, conduites sur l’automate Adiafood dont Bio- Mérieux a hérité en rachetant AES Chemunex en 2011. Pour compléter le tout, la méthode inclut un protocole de confirmation dont l’ambition est d’aider à statuer mieux et plus vite sur la dangerosité du lot. Il n’y a plus d’échantillons présomptifs positifs sans possibilité de confirmation.

Cette méthode globale introduite par BioMérieux est-elle efficace pour détecter les STEC dans les produits laitiers à risque ? Les premières évaluations semblent indiquer que oui. En coopération avec des groupes fromagers et le Laboratoire national de référence, le spécialiste français du diagnostic a de fait réalisé deux études d’évaluation. L’une, étendue au dépistage dans les laits et les fromages au lait cru, à la fois de vache et de brebis, a eu lieu pendant l’hiver 2013/2014. L’autre, centrée sur le dépistage dans les laits et les fromages au lait cru de brebis, s’est déroulée au printemps 2014. Au total, ce sont plusieurs centaines d’échantillons qui ont été analysés, pour l’une et l’autre campagne.

« Ces deux études nous donnent des raisons d’être satisfaits; car elles montrent que notre méthode améliore de manière très nette la performance de dépistage comparativement à la méthode décrite par le projet de norme l’ISO/TS 131362012. Pour ne citer qu’un chiffre, la première campagne indique que notre approche permet de diviser par dix le nombre d’échantillons testés positifs à l’étape de screening des gènes de virulence. Nous n’avons obtenu aucun faux négatif ni lors de la première ni lors de la deuxième étude », se félicite le responsable recherche et développement.

VIRULENCE ET SÉROGROUPES DÉTECTÉS EN UNE FOIS

Sur le marché très disputé du diagnostic, les autres fournisseurs ne sont pas en reste. Pall Genedisc Technologies a ainsi introduit une méthode dont le principe consiste à rechercher les sérogroupes pathogènes ainsi que leurs gènes spécifiques de virulence, en une seule fois, par PCR. Une approche là encore originale. Car, au lieu des facteurs classiques de virulence, le kit recherche des séquences spécifiques pour chaque sérogroupe pathogène. Il permet de dire, dès le premier screening, si l’ensemble des gènes de virulence sont portés par le même sérogroupe pathogène (avec un kit disponible dans deux versions : l’une pour le dépistage du top 5 et l’autre pour le dépistage du top 7). « Nous avons cherché à améliorer la performance du dépistage tout en restant en ligne avec l’ISO/TS 13136 et avec les perspectives d’évolutions réglementaires. C’est important. L’Europe discute actuellement un projet qui distinguerait deux cas selon le risque : un cas où il faudrait rechercher le gène de virulence stx uniquement, et un cas où il faudrait rechercher les sérogroupes hautement pathogènes.Tout l’intérêt de notre méthode est qu’elle est cohérente avec ces deux approches. Notre protocole est par ailleurs fortement discriminante, avec un voyant rouge qui s’allume seulement pour un petit nombre d’échantillons. Pour tous les autres, il n’y a pas besoin d’aller jusqu’à la confirmation des résultats. C’est à la fois un gain de temps et un gain d’argent », souligne la directrice de GeneDisc Technologies, Sirine Assaf.

À l’appui de sa méthode, le spécialiste du diagnostic a réalisé une étude en coopération avec un groupe industriel fromager. Cette étude, qui a porté sur quatre mille échantillons de lait cru, a duré dix-huit mois. Les résultats seront publiés prochainement. Sans attendre, plusieurs industriels fromagers ont adopté la méthode de Pall Genedisc Technologies. Il faut dire que cette dernière possède déjà des cautions : avec un résultat en 18 heures pour l’analyse des laits et des fromages, elle exploite un brevet de l’Anses, et est désignée comme méthode de référence dans un document officiel de la DGAL.

LES NANOTECHNOLOGIES COMME NOUVELLE PISTE

Biorad en est lui seulement au stade du développement. Mais la piste qu’il explore, basée sur l’utilisation des nanotechnologies, n’en fait pas moins parler d’elle. Depuis 2011 en effet, l’entreprise américaine travaille sur une technologie dérivée de la PCR : la Digital PCR dont le principe consiste à diviser la prise d’essais en un très grand nombre de fractions, avec une analyse séparée de chaque fraction. Dans le concept pour lequel Biorad a déposé un brevet, la Droplet Digital PCR, la prise d’essais est divisée en 20 000 gouttes à la taille du nanolitre. « Notre objectif est de parvenir à matérialiser la présence du gène stx par une couleur, et celle du gène eae par une autre couleur. Nous saurons dire de cette manière si le gène stx et le gène eae se retrouvent dans la même gouttelette, et nous pourrons de statuer sur la virulence de la souche sans étape supplémentaire », confie Jean-Philippe Tourniaire, chef produit. Quant à savoir à quel horizon cette piste a des chances d’aboutir, Biorad admet que ce n’est pas pour tout de suite. Le spécialiste américain du diagnostic a du reste un autre projet dans ses tiroirs : en relation avec un laboratoire académique, ses équipes travaillent sur une approche alternative dont l’ambition est de resserrer le dépistage sur les EHEC sans interférence avec les Escherichia coli non pathogènes. Là encore, il s’agit d’une approche expérimentale encore loin d’une utilisation en routine. Mais cette méthode a fait l’an dernier l’objet d’un poster lors d’un rendez-vous international, soit une première marque de reconnaissance.

_{La liste des méthodes citées dans cet article n’a pas de caractère exhaustif}