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Au laboratoire PCR de Zoetis, à Torcé dans la Sarthe
Les virus BI traqués par le diagnostic PCR

La méthode PCR en temps réel est une technologie de pointe dont le laboratoire d’analyses de Torcé s’est fait une spécialité. Il l’utilise pour suivre la circulation des sérotypes du coronavirus de la bronchite infectieuse.

PCR : trois petites lettres qui font désormais partie de notre jargon et qui désignent une méthode d’analyse pour aider au diagnostic d’une pathologie. À partir d’écouvillons prélevés en élevage par le technicien ou le vétérinaire, elle vise à retrouver les traces, à quantifier voire à identifier le virus ou la bactérie suspecté(e) d’être à l’origine de la maladie. Mais sait-on vraiment ce qui se cache derrière ce sigle ? Il correspond au terme anglophone  "polymerase chain reaction", traduit textuellement en français par « réaction en chaîne par polymérase ». « La PCR en temps réel utilise les mécanismes naturels de copies de l’ADN/ARN d’un être vivant, mais de façon in vitro », résume Françoise Blond, responsable du laboratoire d’analyses PCR de Zoetis. Cette technique de biologie moléculaire, utilisée dans de nombreux domaines et notamment en criminologie, permet de multiplier en très grand nombre un fragment très ciblé d’ADN ou d’ARN à partir d’une très petite quantité et à l’aide d’amorces spécifiques. Ces « étiquettes » qui se collent sur un matériel génétique donné permettent de l’identifier par comparaison avec des souches connues. « Rechercher un petit bout de matériel génétique, c’est comme chercher une aiguille dans une botte de paille. La PCR permet de multiplier le nombre d’aiguilles et d’augmenter les chances de la retrouver », schématise la vétérinaire.

Des techniques et des domaines d’application très variés

Cette méthode d’amplification du matériel génétique est relativement jeune (la découverte date de 1986, et le prix Nobel de chimie de 1993). Très coûteuse il y a encore quelques années, elle est devenue beaucoup plus accessible et surtout plus rapide. Elle est aujourd’hui pratiquée par de nombreux laboratoires de recherche ou d’analyses. Elle est complémentaire à d’autres méthodes courantes, comme l’Elisa qui, à partir d’échantillons de sang, mesure la réaction immunitaire (quantité d’anticorps) de l’oiseau après infection. L’avantage de la PCR est d’indiquer avec beaucoup de précision le virus en cause.

Si le principe général de la PCR est toujours le même (extraction de l’ADN ou ARN, multiplication et révélation), il existe en réalité une multitude de techniques. Pour des recherches PCR sur des pathologies à déclaration obligatoire (influenza aviaire, botulisme), la méthode utilisée est très standardisée et est réservée à des laboratoires sélectionnés et agréés. Pour d’autres, il existe plusieurs modes opératoires possibles, chacun faisant référence à une méthode validée de son choix. « C’est notamment le cas du coronavirus responsable de la bronchite aviaire », précise Françoise Blond.

Une technique de choix pour suivre la circulation des virus BI

La PCR est de plus en plus utilisée pour suivre l’évolution des virus circulants de la bronchite infectieuse (BI) et adapter les programmes vaccinaux, malgré ses limites (pas de différenciation à 100 % entre les virus sauvages et vaccinaux). L’une des particularités du coronavirus est d’avoir plusieurs souches circulant sur le terrain et d’être en constante évolution. Le challenge BI change avec l’apparition de variants mineurs ou fugaces, ou de souches qui perdurent. L’objectif de la PCR est aussi de faire une cartographie des différentes souches présentes et de les suivre dans le temps.

Centraliser les analyses de la société dans un laboratoire permet d’avoir des résultats harmonisés et comparables… « On réalise deux qPCR successives. » La première (PCR après transcription inverse : RT-PCR) confirme la présence ou non du coronavirus. La seconde, réalisée avec des amorces spécifiques, permet de savoir s’il s’agit d’une des huit souches testées (choisies par le laboratoire, parmi les plus couramment rencontrées en Europe) : Mass, 793 b, D274, Arkansas, Italy 02, D1466, QX et variant 02. « Si l’échantillon analysé montre la présence du coronavirus et si aucune des souches testées n’est identifiée, on fait réaliser en sous-traitance un autre test génétique. Dans le cas du séquençage, il arrive souvent qu’une souche soit non évaluable (pas assez de matériel génétique ou de qualité insuffisante). La PCR ne donne pas de réponse à tout. On ne retrouve que ce que l’on cherche. »

On ne retrouve que ce que l’on cherche

La technique PCR BI en trois étapes

1Extraction de l’ARN

La recherche par PCR du coronavirus de la bronchite infectieuse au laboratoire Zoetis est réalisée à partir d’écouvillons trachéaux ou cloacaux. L’extrémité des écouvillons est placée dans une solution contenant du chlorure de sodium. Le liquide contenant les fragments d’ARN du pathogène recherché passe dans un appareil d’extraction. Ces opérations sont réalisées sous filtration d’air afin d’empêcher toute contamination par du matériel génétique étranger.

Le matériel génétique extrait est versé dans les puits d’une plaque. La technicienne y a versé au préalable chacun des réactifs : la polymérase, les amorces et les sondes spécifiques des huit souches de référence, les inhibiteurs. D’infimes quantités sont manipulées : chaque puit ne contient que quatre microlitres d’échantillon prélevés à partir de soixante microlitres d’extrait.

2Amplification dans le thermocycleur

La plaque est insérée dans un thermocycleur. C’est là qu’a lieu la multiplication de l’ARN. Cet appareil alterne plusieurs cycles de température. Chaque hausse puis baisse de température correspond à une étape de la PCR, phases d’activation et de désactivation des réactifs. C’est ce qui va induire la synthèse de l’ADN, sa scission en deux brins, l’accroche des amorces et des sondes, puis la synthèse de l’ADN… À chaque cycle, la quantité de matériel génétique double. Au bout de quarante cycles, elle est multipliée mille cent milliards de fois soit 1,1x1012.

3Interprétation des résultats

Le laboratoire utilise une méthode qualitative par fluorescence. Des amorces spécifiques à chaque souche s’accrochent au début et à la fin de la séquence de nucléotides du gène de virus recherché. Puis les sondes s’hybrident aussi, chacune d’elle ayant une couleur de fluorescence spécifique. Au cours de la synthèse, les sondes se libèrent, créant de plus en plus de fluorescence. Si aucune fluorescence n’apparaît, c’est qu’il s’agit d’une souche autre que celle correspondant au couple amorce/sondes spécifiques. La cinétique d’évolution de la fluorescence de chaque amorce est ensuite lue sur un graphique puis interprétée.

Une gamme d’analyses PCR très spécifique

Le laboratoire de Zoetis de Torcé, dans la Sarthe, est spécialisé dans la recherche par PCR et a ciblé une demi-douzaine de pathologies. « Notre petite structure est complémentaire des laboratoires d’analyses auxquels font habituellement appel les vétérinaires », précise Françoise Blond. « Notre expertise concerne des analyses très spécifiques qui ne sont généralement pas faites en routine." Zoetis travaille sur les PCR bronchite infectieuse depuis 2002. Depuis deux ans, tous les échantillons BI provenant d’Europe de l’Ouest sont analysés à Torcé, ce qui représente 2500 PCR en 2015 dont 224 provenant de France (75 % en poulet et 25 % en pondeuse). Le service diagnostics est un outil d’aide à la décision des vétérinaires dans leur prophylaxie vaccinale. Il permet d’améliorer les connaissances scientifiques sur des pathologies majeures. L’objectif est aussi de suivre la circulation des différentes souches du virus et de réaliser des enquêtes épidémiologiques. Depuis septembre 2015, il s’ouvre à de nouvelles pathologies (Marek, E. coli) et à de nouvelles espèces.

En plus du laboratoire de diagnostic PCR, le Centre d’excellence aviaire de Zoetis est aussi le centre logistique et de formation dédié aux techniques de vaccination in ovo (gamme de machines Embrex) pour la zone Europe, Afrique et Moyen-Orient.

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